Изобретение относится к медицине, в частности к клинической вирусологии, и может быть использовано для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к вирусам, а также для контроля эффективности лечения. Сущность способа состоит в том, что для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к возбудителям вирусных инфекций соответствующие иммуноглобулины, меченные пероксидазой, добавляют только в разведения сыворотки 1: 200 и 1:3200 и далее из сывороток крови больных с высокими значениями титров готовят разведения сыворотки таким образом, чтобы значения показателя оптической плотности (ОП) находились в пределах прямопропорциональной зависимости от концентрации иммуноглобулинов и за титр антител принимают наименьшее разведение сыворотки, после которого ОП остается на одном уровне. Техническим результатом является повышение точности способа оценки результата ИФА. 7 табл., 2 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической вирусологии, и может найти применение для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к вирусам, а также для контроля эффективности лечения.

В настоящее время определение титров антител методом ИФА является одним из скрининговых тестов для диагностики многих вирусных инфекций.

В литературе приводятся многочисленные данные по оценке гуморального иммунитета с помощью ИФА и конкретные цифры значений титров антител: от 1: 20000 до 1:102400 ("Организацию и проведение мероприятий против Крымской геморрагической лихорадки на территории природных очагов России", методические рекомендации, г. Москва, 2001 г.; авт. свидетельство "Способ диагностики степени тяжести вирусного гепатита В" 4662993/14 от 16.03.89 г.). Однако исследователи, занимающиеся этим вопросом, сталкиваются с рядом трудностей: невозможностью точного установления титра, несовпадением его величины с клиническими симптомами болезни, целесообразностью назначения противовирусного лечения на основании величины показателя титров специфических антител. Значение количественного показателя титра антител играет существенную роль при клинической оценке активности вирусной инфекции, определении тактики ведения пациента, а также при назначении лечения и проведении контроля его эффективности.

Особенно наглядно эти проблемы можно показать на примере инфекций, вызванных цитомегаловирусом (ЦМВ) и вирусом простого герпеса (ВПГ). Диагностика цитомегаловирусной и герпетической инфекций остается до настоящего момента актуальной, подтверждением чего является большое количество методов и тест-систем для их выявления.

Поскольку ЦМВ и ВПГ являются персистирующими в организме человека возбудителями, то у иммунокомпетентных лиц после первичного инфицирования вырабатываются антитела, которые сохраняются в невысоких титрах (от 1:50 до 1: 800) в течение всей жизни и не имеют диагностического значения.

При выявлении у пациента антител в титре более 1:800 необходимо установить причину повышенного значения показателя, особенно при отсутствии клинической симптоматики. Как правило, в этих случаях назначают повторный анализ через определенный срок (2-3 недели), после чего на основании полученных результатов с учетом данных анализа и клинических симптомов ставят окончательный диагноз. Совершенно очевидно, что от качественной точной оценки показателя титра антител зависит тактика назначения лечения специфическими препаратами, которые являются дорогостоящими и обладающими рядом серьезных побочных действий на организм (Руководство по лабораторной диагностике цитомегаловирусной инфекции для врачей. М., 1996).

Основным тестом определения антител является в настоящее время метод ИФА. Однако большинство выпускаемых различными предприятиями тест-систем для ИФА не позволяют дать количественную оценку содержащихся в сыворотке крови человека специфических антител, проследить динамику их роста или снижения в процессе лечения, т.к. предназначены только для определения иммунного статуса: тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу герпеса простого 1 и 2 типов "Герпес-скрин", ЗАО "Биосервис", г. Москва; тест-система иммуноферментная для выявления антител к цитомегаловирусу "ЦМВ-скрин", ЗАО "Биосервис", г. Москва и другие.

Наиболее близкими аналогами являются: "Инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения Ig класса G к цитомегаловирусу ЦМВ-IgG" (ЗАО "ИмДи", Кольцово Новосибирской области), "Инструкция к тест-системе Beктo-BПГ-IgG-стрип" (ЗАО "Вектор-Бест", Кольцово Новосибирской области), "Инструкция к тест-системе Цитомега Стрип G" (ЗАО "НИАРМЕДИК ПЛЮС", г. Москва), "Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу краснухи Краснуха-скрин" (ЗАО "Биосервис", г. Москва), которые предполагают при определении титра антител двукратное разведение сыворотки.

Известно, что титр антител - это максимальное разведение сыворотки, содержащее специфические антитела. При определении иммунного статуса делают одно разведение сыворотки, соответственно прилагаемой к тест-системе инструкции (1: 50, 1: 100) и затем при необходимости рекомендуют ее дальнейшее титрование путем последовательных двукратных разведений. Нами установлено, что при наличии в сыворотке крови антител в титре до величины обратной 1: 600-1:800 существует прямопропорциональная зависимость между значением оптической плотности и показателем титра антител исследуемой сыворотки (фиг.1). Выше этой обратной величины титра прямопропорциональная зависимость нарушается и при дальнейшем двукратном шаге титрования (1:1600, 1:3200, 1:6400 и т. д.) получают ошибку, которая тем больше, чем больше разведение. Это показано прямым титрованием сыворотки, при котором каждое разведение сыворотки делают из цельной сыворотки, при этом установлено, что чем меньше шаг при типировании, тем меньше ошибка.

Такие данные соответствуют основному закону колориметрии Бугера-Ламберта-Бера. В реальных условиях аналитических определений окрашенные вещества при разбавлении или при действии посторонних веществ разрушаются с образованием бесцветных (или иначе окрашенных) продуктов взаимодействия. Вследствие этого наблюдается нарушение прямопропорциональной зависимости между концентрацией и оптической плотностью. Эти нарушения называют положительными или отрицательными отклонениями от закона Бугера-Ламберта-Бера.

Целью настоящего изобретения является повышение точности способа оценки результата ИФА при определении титра антител в сыворотках крови больных при диагностике вирусных инфекций.

Поставленная цель достигается тем, что сыворотку крови, взятой из локтевой вены, в количестве 3-5 мл, получают путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10-15 мин, инактивируют при 56 o С 30 мин, предварительно готовят из нее ряд последовательных двукратных разведений, добавляют иммунопероксидазные коньюгаты и учитывают результаты реакции на АКИ-Ц-01 при длине волны 492 нм, а затем для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к возбудителям вирусных инфекций соответствующие иммуноглобулины, меченные пероксидазой, добавляют только в разведения сыворотки 1:200 и 1:3200 и далее из сывороток крови больных с высокими значениями титров готовят разведения сыворотки таким образом, чтобы значения показателя ОП находились в пределах прямопропорциональной зависимости от концентрации иммуноглобулинов: если величина ОП сыворотки, полученная при обычном двукратном титровании в разведении 1:200 выше 1,6-2,0 по шкале прибора, а в разведении 1: 3200 - меньше 1,0, то сыворотку 1:200 разводят в 2,5 раза и в дальнейшем титруют с интервалом 1:500, а если величина ОП сыворотки в разведении 1:3200 больше 1,0 по шкале прибора, то сыворотку 1:200 разводят в 5 или 10 раз и готовят последующие разведения с интервалом 1:1000 или 1:2000, и за титр антител принимают наименьшее разведение сыворотки, после которого ОП остается на одном уровне (ОП пробы - ОП контроля не менее 0,21).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больная П. наблюдалась в женской консультации по поводу отягощенного акушерского анамнеза.

При исследовании сыворотки больной в ИФА тест-система производства ЗАО "ИмДи", Кольцово, Новосибирской обл. с титрованием сыворотки путем последовательных двукратных разведений титр антител (IgG) к ЦМВ составил 1:25600.

При прямом разведении сыворотки 1:1000 из 1:200 и далее с шагом 1:2000 титр антител (IgG) в сыворотке составил 1:5000 (см. табл. 1).

Диагноз был подтвержден путем обнаружения антигенов ЦМВ методом флюоресцирующих антител.

Пример 2. Больной К. обратился с жалобами на высыпания в области половых органов.

При обследовании сыворотки крови больного в ИФА (тест-система производства "Биосервис", г. Москва), приготовленной путем последовательных двукратных разведений на наличие антител (IgG) к ВПГ у него были обнаружены антитела в титрах: 1:6400 к ВПГ I типа и 1:3200 к ВПГ II типа (см. табл. 2).

Методом прямого титрования сыворотки шагом 1:500 (с разведения 1:1000) титр антител составил к ВПГ I типа - 1:2000 и 1:1500 к ВПГ II типа (см. табл. 3).

Диагноз был подтвержден путем обнаружения антигенов ВПГ методом флюоресцирующих антител.

Пример 3. Женщина во второй половине беременности обратилась к врачу по поводу контакта с ребенком, которому был поставлен диагноз краснушной инфекции. Беременная не знала, болела ли она краснухой в детстве - при серологическом исследовании в ИФА у нее были обнаружены антитела (IgG) к вирусу краснухи в титре 1:1600 при двукратном разведении сыворотки.

Через две недели был проведен повторный забор крови и исследованы парные сыворотки при аналогичном способе титрования. Титр антител остался прежним (см. табл. 4).

При анализе парных сывороток с шагом разведения 1:500 (из исходных 1: 200) титр антител составил 1:1000 (см. табл. 5).

Пример 4. Больной Е. обратился в глазное отделение с жалобами со стороны органов зрения и ему был поставлен диагноз вирусное заболевание глаз.

При исследовании в ИФА (тест-система производства ЗАО "НИАРМЕДИК ПЛЮС", г. Москва) сыворотки больного, приготовленные путем последовательных двукратных разведений, были выявлены иммуноглобулины класса G к ЦМВ в титре 1:3200 (см.фиг.2), (см. табл. 6).

Исследование той же сыворотки титрованием с шагом 1:200, начиная с разведения 1:1000 показало, что в сыворотке больного Е, титр антител к ЦМВ составил 1:1200. (см. табл. 7).

Диагноз был подтвержден путем обнаружения антигенов ЦМВ методом иммунофлюоресцентного анализа.

Таким образом, предлагаемый способ определения титров антител методом ИФА позволяет более точно оценивать величины титров антител в пределах прямопропорциональной зависимости ОП от их концентрации в сыворотке крови, контролировать их изменения как в ходе заболевания, так и в процессе лечения. Данный способ может быть рекомендован для определения титров специфических антител и при других инфекциях.

Способ определения титров антител методом иммуноферментного анализа при диагностике вирусных инфекций путем приготовления ряда последовательных двукратных разведений сыворотки, добавления иммуно-пероксидазных конъюгатов и учетом результатов реакции на АКИ-Ц-01 при длине волны 492 нм, отличающийся тем, что для более точной оценки результата ИФА при выявлении антител к возбудителям вирусных инфекций соответствующие иммуноглобулины, меченные пероксидазой, добавляют только в разведения сыворотки 1: 200 и 1: 3200 и далее из сывороток крови больных с высокими значениями титров готовят разведения сыворотки таким образом, чтобы значения показателя оптической плотности (ОП) находились в пределах прямопропорциональной зависимости от концентрации иммуноглобулинов: если величина ОП сыворотки в разведении 1: 200 выше 1,6-2,0 по шкале прибора, а в разведении 1: 3200 - меньше 1,0, то сыворотку 1: 200 разводят в 2,5 раза и в дальнейшем титруют с интервалом 1: 500, а если величина ОП сыворотки в разведении 1: 3200 больше 1,0 по шкале прибора, то сыворотку 1: 200 разводят в 5 или 10 раз и готовят последующие разведения с интервалом 1: 1000 или 1: 2000 и за титр антител принимают наименьшее разведение сыворотки, после которого ОП остается на одном уровне (ОП пробы - ОП контроля не менее 0,21).

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения защитных антител к бактериям C-Diphtehriae и в производстве гипериммунных сывороток

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно - к лабораторной диагностике

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к лабораторной диагностике

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и коз

Когда резус-фактор крови мужчины и женщины несовместим, при беременности это становится очень серьезной проблемой. Она существенно повышает возможность резус-конфликта с ребенком.

Все знают, что если у будущих родителей резус не совпадает, беременность может вызвать смешение крови. Как следствие, организм матери начинает вырабатывать для защиты антитела. Они распознают чужеродные тела и уничтожают их. Если это бактерии, вирусы, опухоли, это неплохо, но при беременности антитела смертельно опасны и грозят гибелью плода

Анализ на антитела

Семейные пары, планируя беременность, должны сдать кровь в обязательном порядке. На основании его данных специалисты определяют группу крови, а также резус-фактор и до наступления беременности оценивают потенциальный риск и составляют схему его предупреждения и устранения. Кровь на антитела сдается ежемесячно, начиная с пятой недели беременности. Если показатель высокий, это не приговор. Сегодня врачи используют разные методы медикаментозного лечения, основная цель которых - регулировать реакции иммунной системы. В их числе плазмоферез. Если все сделано вовремя и правильно, малыша удается спасти, при этом он будет развиваться как положено.

Если при беременности обнаружены антитела, нужно следить за их количеством в крови и здоровьем ребенка. Кроме этого, проводится такой анализ, как типирование антител. Выделяют несколько их видов, каждый обладает своей способностью уничтожать кровяные клетки плода. Результаты анализа на антитела позволяют определить вероятность возникновения гемолитической болезни. Регулярное ультразвуковое исследование, проводимое при беременности, и допплерометрия помогают оценить состояние ребенка и необходимость проведения лечебных мероприятий.

При первой беременности смешение крови женщины и ребенка происходит уже после его рождения. Даже если антитела появились, они не способны причинить вред организму младенца. При всех последующих беременностях вероятность резус-фактора возрастает в несколько раз. Когда в организме есть антитела, беременность может завершиться очень печально. В серьезных случаях плод погибает, находясь в утробе матери.

Беременность и резус-конфликт

Серьезные проблемы возникают при следующих обстоятельствах:

• попадание во время родов несовместимой крови ребенка в организм женщины, в результате вырабатываются антитела, которые в последующем активизируются на положительный резус,
• смешение крови ребенка и матери во время внематочной беременности, выкидыша, медицинского аборта при наступлении беременности существует риск осложнений,
• антитела могут появиться при выполнении предродовых анализов - биопсия хориона или амниоцентез, в этих случаях может смешаться кровь ребенка и матери.

Осложнения

В некоторых случаях резус-конфликт является причиной гемолитических заболеваний. В такой ситуации малыша можно спасти только путем переливания крови. Специалисты рекомендуют выполнять эту процедуру, когда плод находится в животе матери. После родов ребенка отправляют в реанимацию и снова делают переливание крови. Бывает, что резус-конфликт возникает не сразу, но со временем в организме младенца развивается желтуха. Огромное количество билирубина оказывает отрицательное влияние на клетки головного и спинного мозга, прежде всего, подкорковых ядер, итогом становится проявление неврологической симптоматики. Как правило, лечение проводится с помощью специализированной люминесцентной лампы, которая снижает билирубин в крови.

Разрушение эритроцитов становится причиной резкого снижения их уровня, что влияет на показатель гемоглобина в крови. Как следствие, ткани и клетки растущего плода обеспечиваются кислородом в недостаточном количестве. Если гемолитическая болезнь протекает в этой форме, ее называют анемической. Снижение количества эритроцитов запускает их повышенную выработку в селезенке и печени, в результате органы увеличиваются в размерах. Если ребенок пока не появился на свет, такое состояние органов можно обнаружить при проведении ультразвукового исследования.

Самая опасная форма гемолитической болезни - отечная. Снижение количества белка в крови, нарушения, происходящие в клетках, вызывают отек тканей. Ребенок появляется на свет в плохом состоянии: неврологическая симптоматика, выраженная анемия, нарушения сердечной и дыхательной системы, все это практически не оставляет младенцу возможности выжить.

Сегодня медицина очень развита, поэтому женщины, у которых отрицательный резус, имеют возможность выносить и родить полноценного ребенка. Для этого используется анти-Д гамма-глобулин, его основная задача — не допустить попадания красных кровяных телец ребенка в кровь матери, как следствие, антитела не вырабатываются. Такие инъекции рекомендуется делать всем женщинам, так как с точностью установить резус-фактор у плода пока невозможно. Анти-Д гамма-глобулин поможет не допустить осложнений при любых отрицательных факторах, которые становятся причиной плацентарного кровотечения. Препарат безвреден для плода, но важно, чтобы он был тщательно проверен на гепатит и СПИД.

На первой консультации у гинеколога нужно определить группу крови беременной женщины по резус-фактору. Анализ крови на антитела позволяет контролировать наличие и интенсивность реакции женского организма на несовместимую кровь плода. Если антитела обнаружены, необходимо внимательно следить за состоянием ребенка. Проводится ультразвуковое исследование, аминоцентез, кордоцентез. В установленные сроки проводятся инъекции антирезусного иммуноглобулина. Также врач принимает решение, сможет ли женщина доносить ребенка или придется вызывать преждевременные роды.

В некоторых случаях беременным назначают анализ на антитела к сперме мужа. Как правило, он проводится, если все прежние беременности у женщины заканчивались выкидышами. Процедура не из приятных, но она помогает предотвратить возникновение серьезных заболеваний у будущего ребенка.

Если вы готовитесь зачать ребенка, об этом следует сказать врачу. Вам могут назначить на стадии подготовки кровь на наличие антител к так называемым TORCH-инфекциям. Эта группа включает такие заболевания, как краснуха, токсоплазмоз, герпес, цитомегаловирус, которые крайне опасны для младенца. Они нередко приводят к выкидышу или преждевременным родам и губительно воздействуют на органы плода, повышая вероятность появления на свет ребенка с уродствами или различными аномалиями развития. Особенно негативно перечисленные болезни влияют на функции нервной системы. Вот почему при первичном заражении подобным заболеванием медики настаивают на прерывании беременности. При обнаружении в крови женщины антител к TORCH-инфекциям еще до наступления беременности позволяет будущей маме быть уверенной, что ее малышу ничего не угрожает.

Важно, чтобы в крови беременной присутствовали антитела к краснухе, поскольку это особенно коварная инфекция. Если же иммунитет отсутствует или снижен, о чем будет свидетельствовать низкий титр антител, тогда стоит до наступления беременности сделать прививку.

Как правило, анализ крови на напряженность иммунитета к TORCH-инфекциям сдается женщиной на сроке 8 недель беременности. Наличие антител IgМ будет свидетельствовать о том, что заболевание уже протекает в организме, а если выявлены антитела IgG, тогда можно утверждать, что заражение произошло до беременности. В данном случае нет оснований опасаться за здоровье ребенка.

Резус- конфликт: почему несовпадение губительно

Развиться резус-конфликт может, когда различны резус-фактор плода и матери. Причем, положительный резус малыша повышает вероятность конфликта, а, следовательно, и последствия будут более серьезными, чем при отрицательном резусе . В ситуации, когда кровь мамы имеет резус с минусом, а папина кровь положительный показатель, большая вероятность (75%) развития резус-конфликта с плодом.

С наступлением беременности кровь женщины начинает интенсивно вырабатывать защитные антитела, которые разрушают эритроциты плода, попадая в его кровоток. В результате будущий ребенок испытывает нехватку кислорода, что приводит к развитию гемолитической болезни. Поэтому, женщина в подобной ситуации должна регулярно обследоваться на антитела. Увеличение числа антител будет свидетельствовать о начале резус-конфликта. Это потребует проведения срочных мероприятий. Обычно женщине в таком случае на 7 месяце беременности назначается антирезусный иммуноглобулин. Повторно его вводят на третьи сутки после родов.

Интересно, что одинаковые резус-факторы у родителей, но разные группы крови не исключают развитие конфликта по резусу. Поэтому, те женщины, которые имеют первую группу, должны в период беременности сдать еще кровь на групповые антитела.